一、產品介紹
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外 觀： |
白色無定形粉末或無色透明液體 |
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蛋白比活： |
≥20,000 KU/mg protein |
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純 度： |
不含RNase、蛋白酶、其它DNA內切酶和外切酶；≥95%(SDS-PAGE) |
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穩 定 性： |
-20℃至少穩定2年 |
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分 子 量： |
~35kD的糖蛋白 |
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等 電 點： |
6.0左右 |
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抑 制 劑： |
EDTA 、EGTA、SDS、DTT、β-巰基乙醇等還原劑 |
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激 活 劑： |
Mg2+，Mn2+，Ca2+，Co2+ |
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pH穩定性： |
4.0-9.0（25℃，24h） |
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最適 pH： |
6.0 |
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最適溫度： |
活力隨溫度（20℃-60℃）升高逐漸升高；37℃測值為25℃測值的3.3倍。 |
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熱穩定性： |
55℃以下穩定；60℃加熱30min后活力依然保留50%以上；70℃以上失活。。 |
二、酶活測定方法
1. 原理
利用DNase降解DNA生成寡核苷酸時260nm處的吸光值會升高的原理，在一定條件下，OD260每分鐘的增加率與DNase的含量成正比例。以牛胸腺DNA為底物，在pH5.0、25℃條件下，1Kunitz unit能使OD260每分鐘增加0.001。
2. 測活試劑
2.1 1M 醋酸鈉緩沖液 (pH 5.0)：將13.6g醋酸鈉溶于80ml去離子水，再用6M HCl調pH 5.0（25℃），加去離子水定容至100ml，室溫保存。
2.2 100mM MgSO4：將1.2g MgSO4溶于100ml去離子水，室溫保存。
2.3 0.033% (W/V)小牛胸腺DNA
1）將100mg 小牛胸腺DNA（欣經科 貨號：7026）溶于300ml預冷的去離子水中，冰浴至少30min，緩慢攪拌至完全溶解。分裝后，凍存于-20℃。臨用前在37℃解凍。
2）測定DNA的濃度
a. 用去離子水將1.1.3底物DNA樣品稀釋N倍（10-30倍），以去離子水作為陰性對照。
b. 用UV分光光度儀測定OD260，以陰性對照歸零。
c. 1個OD260單位相當于50μg/ml DNA，DNA濃度的計算公式如（1.1）。
（1.1）
2.4 酶稀釋液：即0.85% NaCl（150mM）。將0.85g NaCl溶于100ml去離子水，室溫保存。
2.5 反應液R
1）按下表配置50ml 反應液R。
2）輕柔混勻后，用0.1M HCl和0.1M NaOH調pH 5.0 (25oC)。2-8℃可穩定保存至少2個月。
3）*注意：根據4.3測得的DNA濃度適當添加去離子水和底物DNA。測活試劑R中DNA的終濃度為0.004%(w/v) ，即40ug/ml，OD260吸光值為0.8。
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試 劑 |
ml |
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1M 醋酸鈉(pH 5.0) |
5.0 |
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100mM MgSO4 |
2.5 |
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0.033% (W/V)小牛胸腺DNA |
6.0* (2.0mg of DNA) |
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去離子水 |
36.5* |
1. 待測樣品的配制
測活前，用酶稀釋液溶解重組型bpDNase I干粉后，再用酶稀釋液將酶液稀釋至200-500 Kuniz units/ml，按以下步驟檢測酶活。
2. 酶活檢測步驟
在1cm的石英比色杯中加入2.5ml 2.2.2測活試劑R，25℃條件下保溫1.5min后，加0.5ml待測樣品，迅速混勻，在260nm波長下讀取2min內最大的吸光度變化率（ΔA260nm/min Sample）。同時以0.5ml去離子為空白對照，記錄ΔA260nm/min Blank。按照以下公式計算酶活力。線性范圍是400-500U/ml。3.00ml反應體系含83mM 醋酸鈉緩沖液(pH5.0)，4.2mM MgSO4，25mM NaCl，33.33ug/ml小牛胸腺DNA及200-250 Kuniz units DNase I。酶活力計算公式：
Activity（Kunitz Units/ml）= (ΔA260nm/min Sample -ΔA260nm/min Blank) X (3) X D =△A/min×6000×D
0.001×0.5×1
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Vt |
反應液總體積 （3ml） |
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ε |
0.001 = ΔA 260nm per the unit definition |
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Vs |
樣品體積 (0.5ml) |
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d |
比色皿光程 (1cm) |
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D |
稀釋倍數 |
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△A/min |
△A/min Sample －△A/min Blank（單位：Abs/min） |
三、酶性質
IVD原料